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重組表達蛋白純化后為什么會發生沉淀?

重組表達蛋白純化后發生沉淀,這種情況一般發生在鎳離子親和純化蛋白中發生的最多,純化后的蛋白發生沉淀主要有這么幾種原因:
第一:在Ni純化的過程中,有一部分鎳離子會脫落,脫落的鎳離子屬于重金屬,會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用;
第二:我們人為人工制造的這種溶液環境,不一定真正符合蛋白本身的“生存”的環境要求,所以要從離子濃度和pH去考慮,特別是鹽離子濃度;
第三:找準蛋白質的一個等電點,溶液環境的ph值不能在蛋白質等電點的附近,如果在等電點的附近的時候,這個時候蛋白非常容易沉淀;
第四:蛋白反復凍溶,過程中生成的一些小冰晶會對這個蛋白的結構造成一定的傷害,離子和緩沖液狀態發生較大變化;
第五:如果長時間放在4度的情況之下蛋白質,容易滋生微生物,微生物的生長的可能造成蛋白的性質變化或者降解也容易產生一些聚集沉淀。
 
是不是沉淀的蛋白就一定完全失去了結構活性呢?這個是不一定的,我們曾經做過這樣一個案例,一個紅色熒光蛋白表達。放在4度放了一周,很多的蛋白都沉淀下來了,但是沉淀物依然是紅色的,這個案例說明了至少這個蛋白,蛋白質沉淀后只是部分失活或者結構變性。如何避免和解決重組蛋白純化后聚集沉淀呢?
 
我們提出以下幾個建議:
1.我們建議如果用鎳柱來純化蛋白的時候,純化的過程純化之后的溶液當中適當的加一點EDTA,讓它螯合脫落下來的鎳離子,減少重金屬對蛋白的傷害。
2.我們可以加點分散劑,避免蛋白質分子接觸碰撞,減少它的聚集,這些分散劑,比如說甘油,聚乙二醇,甘露醇,還有這個山梨醇之類的。
3.我這個蛋白的話允許你加入一些輔助性的保護蛋白的話,那是最好比如說這個白蛋白。
4.可以加一點個氨基酸,比如說精氨酸。
5.準確的算出蛋白質的pI等電點,算等電點是要把整個蛋白包括融合的部分都代入計算,包括載體上的人和蛋白,所以這樣才能算出一個準確的等電點,溶液的環境的pH值,要避免在等電點附近。
6.一個蛋白有些蛋白比較嬌貴,有些蛋白比較皮實,在這過程中的話,我們還要避免蛋白的一些熱損傷。
7.很多的蛋白的話,它獨立的時候是很難存在的,它必須有一些輔助的離子或者輔助的一些蛋白,它才能夠一個很好的維持一個很好的一個構象,所以必要的時候添加它的一些輔助的蛋白或者是因子。
8.每個蛋白的情況都不一樣,也許你在處理其他蛋白的時候都很好,但是處理這個蛋白的時候情況完全不一樣,這就是為什么呢?我們研究的這些蛋白,有時候沒有一招鮮或者是通用方案;我們曾遇過這樣的一個案例,某個寄生蟲體內的一個酶,我們表達的時候,它可以得到上清表達非常好,我們對其中的一個氨基酸進行突變,它立馬從上清表達狀態變到包涵體表達狀態;從這個地方我們是否可以通過加減氨基酸為蛋白質”改命“(改性)。

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